EPCR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402158-ACT

PROCR codifica per il recettore endoteliale della proteina C (EPCR), un recettore di superficie particolarmente arricchito nelle cellule endoteliali che lega la proteina C e la proteina C attivata per regolare la coagulazione e l’omeostasi vascolare. EPCR partecipa a segnali anticoagulanti e citoprotettivi attraverso la via della proteina C, interfacciandosi con risposte dipendenti dai PAR che influenzano l’integrità della barriera endoteliale e il tono infiammatorio. Alterazioni dell’espressione di EPCR o il suo shedding (rilascio/distanacco dalla superficie cellulare) sono stati associati a processi trombo-infiammatori, disfunzione endoteliale e complicanze vascolari rilevanti per la biologia della sepsi e per i meccanismi delle malattie cardiovascolari. In quanto marcatore e regolatore dello stato endoteliale, EPCR viene spesso analizzato in modelli di emostasi, interazioni leucocita–endotelio e danno microvascolare.

EPCR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PROCR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EPCR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PROCR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PROCR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EPCR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PROCR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EPCR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EPCR nelle cellule tumorali con espressione di PROCR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.