EN1/Engrailed 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405900-ACT

EN1 (Engrailed 1) codifica um fator de transcrição homeobox que regula a padronização e a especificação do destino celular durante o desenvolvimento embrionário, com papéis proeminentes na organização do mesencéfalo–rombencéfalo e na diferenciação neuronal. Ao se ligar a elementos cis-regulatórios, o EN1 coordena programas de expressão gênica que moldam a morfogênese, a orientação axonal e a manutenção de linhagens, interagindo com redes de sinalização do desenvolvimento, incluindo saídas transcricionais associadas a Wnt, FGF e Hedgehog. Em tecidos adultos e em modelos de doença, a alteração da expressão de EN1 tem sido associada a estados de diferenciação desregulados e a circuitos transcricionais aberrantes. Essas características fazem do EN1 um nó útil para estudar redes regulatórias gênicas do desenvolvimento e o controle transcricional dependente do contexto em sistemas celulares humanos.

EN1/Engrailed 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EN1/Engrailed 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EN1/Engrailed 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EN1/Engrailed 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EN1/Engrailed 1 em células tumorais com expressão de EN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.