EHD2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403776-ACT

EHD2 (EH domain containing 2) è un’ATPasi correlata alla dinamina che si associa alle caveole e al citoscheletro corticale di actina per regolare la curvatura di membrana, il traffico endocitico e la stabilità delle caveole. Limitando la dinamica delle caveole e influenzando la scissione e il riciclo delle vescicole, EHD2 contribuisce ai meccanismi di meccanotrasduzione e alle vie di gestione dei lipidi che modellano l’adesione cellulare, la migrazione e le risposte alla tensione di membrana. Una deregolazione del traffico caveolare e dell’accoppiamento con il citoscheletro che coinvolge EHD2 è stata collegata in letteratura ad alterazioni dell’omeostasi metabolica e a fenotipi oncogenici, inclusi cambiamenti nell’invasività cellulare e nella compartimentalizzazione della segnalazione. Di conseguenza, EHD2 è spesso oggetto di studio in ricerche su endocitosi, organizzazione della membrana plasmatica e segnalazione dipendente dalle caveole nelle cellule umane.

EHD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EHD2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EHD2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EHD2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EHD2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EHD2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EHD2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EHD2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EHD2 nelle cellule tumorali con espressione di EHD2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.