EDG-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402843-ACT

O LPAR1 humano codifica o EDG-2, um receptor acoplado à proteína G (GPCR) responsivo ao ácido lisofosfatídico (LPA) que se acopla principalmente a Gαi, Gαq e Gα12/13 para regular as vias de sinalização MAPK/ERK, PI3K–AKT, PLC–Ca2+ e o remodelamento do citoesqueleto dependente de Rho/ROCK. Por meio dessas vias, o EDG-2 influencia a migração, adesão, proliferação e sobrevivência celulares, bem como as interações com a matriz extracelular, integrando sinais de mediadores lipídicos em processos de remodelamento tecidual e respostas inflamatórias. A atividade do LPAR1 é frequentemente estudada em contextos nos quais a sinalização por LPA molda a comunicação entre estroma e sistema imune, a função de barreira vascular e epitelial e a ativação de fibroblastos. A desregulação da sinalização do EDG-2 tem sido associada na literatura à invasão relacionada ao câncer, ao remodelamento fibrótico e a processos neuroinflamatórios, tornando-o um nó relevante para a dissecação mecanística de vias.

EDG-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LPAR1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EDG-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LPAR1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LPAR1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EDG-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LPAR1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EDG-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EDG-2 em células tumorais com expressão de LPAR1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.