DOCK 7 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-426491-ACT

Dock7 codifica DOCK7, un fattore di scambio di nucleotidi guaninici atipico che attiva preferenzialmente le GTPasi della famiglia Rho, come RAC1 e CDC42, coordinando il rimodellamento del citoscheletro di actina, la polarità cellulare e la migrazione direzionale. Nel sistema nervoso del topo, DOCK7 contribuisce alla differenziazione neuronale, alla crescita degli assoni e alla biologia delle cellule di Schwann attraverso reti di segnalazione che collegano segnali di membrana alla dinamica del citoscheletro. Queste funzioni collocano DOCK7 all’interno di vie che regolano l’estensione dei neuriti e la mielinizzazione, con una rilevanza più ampia per la neurobiologia dello sviluppo e per i programmi di motilità cellulare. Un’alterata attività di DOCK7 è stata associata a fenotipi di neurosviluppo ed è stata studiata in contesti in cui una segnalazione delle Rho GTPasi deregolata influisce sulla morfogenesi dei tessuti e sulla formazione dei circuiti neurali.

DOCK 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Dock7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DOCK 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Dock7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Dock7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DOCK 7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Dock7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DOCK 7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DOCK 7 nelle cellule tumorali con espressione di Dock7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.