DOCK 7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404461-ACT

DOCK7 (DOCK 7) è un fattore di scambio di nucleotidi della guanina (GEF) atipico che attiva le GTPasi della famiglia Rho, in particolare Rac1 e Cdc42, per coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina, la polarità cellulare e la migrazione direzionale. Attraverso questi nodi di segnalazione, DOCK7 contribuisce alla crescita dei neuriti, alla guida assonale e ai processi legati alla mielinizzazione, collegando la dinamica del citoscheletro alle vie di sviluppo e di traffico intracellulare. Alterazioni dell’attività di DOCK7 sono state associate a fenotipi di neurosviluppo e a programmi di motilità cellulare deregolati, rilevanti per lo studio dello sviluppo del sistema nervoso e della biologia legata all’invasività. In quanto scaffold di segnalazione e regolatore di GTPasi, DOCK7 viene inoltre utilizzato per indagare il cross-talk tra la segnalazione delle GTPasi Rho, la dinamica delle membrane e le vie dipendenti da chinasi che controllano morfologia e adesione.

DOCK 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DOCK7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DOCK 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DOCK7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DOCK7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DOCK 7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DOCK7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DOCK 7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DOCK 7 nelle cellule tumorali con espressione di DOCK7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.