Dnmt2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402709-ACT

TRDMT1 codifica Dnmt2, una metiltransferasi citosina-5 evolutivamente conservata che metila principalmente specifici tRNA, in particolare il tRNA^Asp, per sostenere la stabilità dell’RNA e la proteostasi in condizioni di stress cellulare. Attraverso la metilazione dell’RNA, Dnmt2 contribuisce alla fedeltà della traduzione, alla segnalazione della risposta allo stress e al mantenimento della regolazione epitranscrittomica, che può influenzare i programmi di crescita e differenziamento cellulare. Un’alterata attività di TRDMT1 è stata collegata a cambiamenti nei pattern di modificazione dell’RNA associati alla stabilità genomica, all’apoptosi e alla suscettibilità ai danni indotti dallo stress. La disregolazione di questi processi è rilevante per studi meccanicistici in biologia del cancro, neurobiologia e segnalazione infiammatoria, ambiti in cui la modificazione dell’RNA e il controllo della traduzione risultano spesso perturbati.

Dnmt2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRDMT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dnmt2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRDMT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRDMT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dnmt2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRDMT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dnmt2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dnmt2 nelle cellule tumorali con espressione di TRDMT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.