DNA-PK_CS Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400337-ACT

PRKDC codifica a subunidade catalítica da proteína quinase dependente de DNA (DNA-PKCS), um regulador central da resposta a danos no DNA que acopla o reconhecimento das extremidades do DNA ao reparo. A DNA-PKCS forma a holoenzima DNA-PK com o heterodímero Ku70/Ku80 para coordenar a junção de extremidades não homólogas (NHEJ), promovendo o reparo de quebras de dupla fita, a recombinação V(D)J e a manutenção da estabilidade do genoma. Por meio da fosforilação de si mesma e de múltiplos fatores de reparo e sinalização, a DNA-PKCS integra-se à sinalização de ATM/ATR, às respostas ao estresse replicativo e ao remodelamento da cromatina. A atividade ou expressão desregulada de PRKDC está associada a radiossensibilidade alterada, fenótipos de imunodeficiência e instabilidade genômica observados em diversos contextos de pesquisa em câncer e neurodegeneração.

DNA-PKCS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRKDC sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA-PKCS O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRKDC em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRKDC, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA-PKCS. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRKDC nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA-PKCS no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA-PKCS em células tumorais com expressão de PRKDC silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.