DinB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405052-ACT

Il gene umano **POLK** codifica per la DNA polimerasi kappa (DinB), una polimerasi di sintesi translesione della famiglia Y che consente la replicazione del DNA attraverso lesioni ingombranti, come i fotoprodotti indotti dai raggi UV e gli addotti del benzo[a]pirene. Promuovendo la tolleranza al danno durante la fase S, POLK contribuisce a mantenere la progressione della forcella replicativa e influenza gli spettri mutazionali quando il bypass avviene con fedeltà ridotta. POLK agisce all’interno di reti della risposta al danno al DNA che coordinano il bypass delle lesioni, lo switch tra polimerasi e la riparazione post-replicativa, collegandosi così alla stabilità del genoma e all’adattamento cellulare allo stress. Un’attività di POLK deregolata o un’espressione alterata è stata associata a mutagenesi e instabilità genomica in contesti rilevanti per la biologia del cancro e per modelli di danno al DNA legati all’esposizione.

DinB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di POLK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DinB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus POLK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione POLK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DinB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus POLK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DinB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DinB nelle cellule tumorali con espressione di POLK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.