Dia 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401929-ACT

DIAPH1 (Dia 1) codifica una formina correlata a Diaphanous che regola la nucleazione e l’allungamento dei filamenti di actina a valle della segnalazione mediata dalle GTPasi Rho. Dia 1 coordina il rimodellamento del citoscheletro necessario per la polarità cellulare, l’adesione, la citochinesi e la migrazione direzionale, e contribuisce anche alla stabilizzazione dei microtubuli attraverso il crosstalk actina–microtubuli. Tramite questi processi, DIAPH1 influenza vie che governano la meccanotrasduzione e la dinamica di membrana, inclusa la formazione di filopodi e l’assemblaggio dell’anello contrattile. Un’attività di DIAPH1 deregolata è stata associata a fenotipi alterati di motilità e divisione cellulare ed è collegata in letteratura a fenotipi dello sviluppo ed ematologici/vascolari, a supporto della sua rilevanza per studi sui meccanismi di malattia.

Dia 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DIAPH1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dia 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DIAPH1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DIAPH1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dia 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DIAPH1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dia 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dia 1 nelle cellule tumorali con espressione di DIAPH1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.