desmoplakin I/II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400818-ACT

DSP codifica la desmoplachina I/II, un citolinker centrale dei desmosomi che ancora i filamenti intermedi alle placche desmosomiali per mantenere l’integrità dei tessuti epiteliali e cardiaci sotto stress meccanico. Attraverso interazioni con desmogleine, desmocolline, plakoglobina e plakofiline, la desmoplachina sostiene l’adesione cellula-cellula, l’organizzazione del citoscheletro e il rimodellamento delle giunzioni durante la differenziazione e la riepitelizzazione associata alle ferite. L’alterazione dell’espressione di DSP o della stabilità dei desmosomi è associata a difetti della funzione di barriera e a una meccanotrasduzione alterata, con rilevanza per fenotipi di cardiomiopatia e fragilità cutanea. Queste caratteristiche rendono DSP un bersaglio utile per studiare la segnalazione giunzionale, la dinamica dei filamenti intermedi e le vie di risposta allo stress che collegano l’adesione all’omeostasi tissutale.

desmoplakin I/II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DSP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

desmoplakin I/II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DSP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DSP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di desmoplakin I/II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DSP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da desmoplakin I/II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via desmoplakin I/II nelle cellule tumorali con espressione di DSP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.