cubilin CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402129-ACT

ヒトCUBNは、近位尿細管および腸管上皮で顕著に発現する、大型の多リガンド性エンドサイトーシス受容体であるcubilinをコードする。Cubilinは、megalin（LRP2）およびアダプタータンパク質amnionless（AMN）と協調して、内因子–ビタミンB12複合体や、アルブミンなど糸球体で濾過された血漿タンパク質といったタンパク質結合性栄養素の、受容体依存的な取り込みとリソソームへの輸送を担う。これらのエンドサイトーシス経路を介して、cubilinは栄養恒常性の維持に寄与するとともに、尿細管でのタンパク質再吸収を調節し、上皮輸送および小胞介在性の取り込みネットワークとその機能を結び付けている。CUBNの破綻または調節異常は、ビタミンB12取り込み障害や腎尿細管でのタンパク質処理異常の表現型と関連しており、腎疾患および消化管疾患の病態生物学に関する機序研究において重要である。

cubilin CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性CUBNの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

cubilin CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における CUBN 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はCUBN転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性cubilinの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のCUBN遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるcubilin依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびCUBN発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるcubilin経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。