CstF-64 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402202-ACT

CSTF2 codifica CstF-64, una subunità legante l’RNA del complesso del fattore di stimolazione del clivaggio (cleavage stimulation factor) che riconosce elementi di sequenza a valle ricchi in GU/U per promuovere il clivaggio dell’estremità 3′ del pre-mRNA e la poliadenilazione. Controllando la scelta dei siti di poliadenilazione alternativa, CstF-64 modella la lunghezza della 3′ UTR, la stabilità dell’mRNA, l’efficienza di traduzione e la localizzazione dei trascritti, collegandosi così alla regolazione globale dell’espressione genica durante proliferazione e differenziamento. La poliadenilazione dipendente da CSTF2 si intreccia con la terminazione della trascrizione e con le vie di processamento dell’RNA, influenzando la diversità delle isoforme e le reti regolatorie post-trascrizionali. La deregolazione della poliadenilazione alternativa e del processamento dell’estremità 3′ è associata ad alterazioni di programmi genici oncogenici e dello sviluppo, rendendo CSTF2 un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sulla maturazione dell’RNA e sul rimodellamento del trascrittoma associato alle malattie.

CstF-64 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CSTF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CstF-64 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CSTF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CSTF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CstF-64. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CSTF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CstF-64 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CstF-64 nelle cellule tumorali con espressione di CSTF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.