CSA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403428-ACT

ERCC8 codifica la proteina A della sindrome di Cockayne (CSA), un fattore con ripetizioni WD40 che funge da componente di riconoscimento del substrato del complesso ligasi E3 dell’ubiquitina CRL4^CSA. CSA è centrale nella riparazione per escissione di nucleotidi accoppiata alla trascrizione, coordinando il riconoscimento delle lesioni in corrispondenza della RNA polimerasi II bloccata e promuovendo un rimodellamento ubiquitina-dipendente dei macchinari di riparazione e di trascrizione per ripristinare l’espressione genica dopo danni indotti dai raggi UV. Attraverso interazioni con CSB/ERCC6 e altri fattori NER, CSA contribuisce a mantenere la stabilità del genoma e supporta il recupero della trascrizione dopo stress genotossico. Varianti patogene di ERCC8 sono associate alla sindrome di Cockayne e a fenotipi correlati di sensibilità ai raggi UV, alterazioni del neurosviluppo e invecchiamento precoce, rendendo la regolazione di CSA rilevante per studi sulla capacità di riparazione del DNA e sulla segnalazione della risposta allo stress.

CSA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ERCC8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CSA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ERCC8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ERCC8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CSA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ERCC8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CSA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CSA nelle cellule tumorali con espressione di ERCC8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.