CMPK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405332-ACT

Il gene umano **CMPK1** codifica la **chinasi del monofosfato di citidina** (CMPK), una chinasi dei nucleosidi monofosfato che catalizza la fosforilazione di **CMP** e **UMP** a **CDP** e **UDP**, contribuendo a mantenere un equilibrio dei pool di nucleotidi pirimidinici necessario per la **replicazione del DNA**, la **trascrizione dell’RNA** e la **biosintesi dei fosfolipidi di membrana**. Contribuendo al recupero (salvage) dei nucleotidi e alla più ampia omeostasi cellulare dei nucleotidi, l’attività di CMPK1 si intreccia con il controllo metabolico della **progressione del ciclo cellulare**, con la **funzione mitocondriale** e con le **risposte allo stress replicativo**. Alterazioni del metabolismo delle pirimidine e squilibri dei nucleotidi sono caratteristiche ricorrenti in stati patologici proliferativi e con metabolismo riorganizzato, rendendo CMPK1 un nodo utile per studiare come la disponibilità di nucleotidi limiti la manutenzione del genoma e la fitness cellulare.

CMPK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CMPK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CMPK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CMPK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CMPK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CMPK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CMPK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CMPK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CMPK nelle cellule tumorali con espressione di CMPK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.