CLCA2 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-404824-ACT-2

Humanes CLCA2 (chloride channel accessory 2) kodiert ein an der Zelloberfläche lokalisiertes bzw. sezerniertes akzessorisches Protein, das an der Regulation der Chloridleitfähigkeit und des epithelialen Ionentransports beteiligt ist und Funktionen in der Membrandynamik sowie in barriereassoziierter Physiologie übernimmt. Die Expression von CLCA2 ist häufig mit Differenzierungs- und stressantwortlichen Programmen verknüpft und überschneidet sich mit Signalprozessen, die Zell-Zell-Adhäsion, Migration und die epitheliale Homöostase beeinflussen. Eine Dysregulation von CLCA2 wurde in mehreren Krebszusammenhängen und anderen epithelialen Erkrankungen beschrieben, was seine Nutzung als molekularen Marker zur Untersuchung tumorassoziierter phänotypischer Übergänge und von Mikroumgebungsreaktionen unterstützt. Die Geneditierung von CLCA2 ermöglicht eine mechanistische Analyse chloridbezogener Signalwege, epithelialen Remodellings und nachgeschalteter transkriptioneller Netzwerke in humanen Zellmodellen.

CLCA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CLCA2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CLCA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CLCA2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CLCA2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CLCA2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CLCA2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CLCA2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CLCA2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CLCA2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.