CENP-B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401356-ACT

CENPB codifica la proteina centromerica B (CENP-B), un fattore di legame al DNA specifico per sequenza che riconosce le ripetizioni centromeriche α-satellite e contribuisce all’organizzazione del centromero e all’assemblaggio del cinetocore. Attraverso interazioni con la cromatina centromerica e con l’ambiente nucleosomiale contenente CENP-A, CENP-B sostiene la fedeltà della segregazione cromosomica e la progressione mitotica. Un’alterata funzione del centromero e l’instabilità cromosomica sono caratteristiche comuni dell’evoluzione tumorale, rendendo la regolazione di CENP-B rilevante per studi su aneuploidia, checkpoint del ciclo cellulare e mantenimento del genoma. CENP-B è inoltre un importante autoantigene bersaglio degli anticorpi anti-centromero, collegando la biologia di CENPB alle ricerche sull’autoimmunità diretta contro il centromero e sul processamento degli antigeni nucleari.

CENP-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CENPB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CENP-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CENPB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CENPB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CENP-B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CENPB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CENP-B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CENP-B nelle cellule tumorali con espressione di CENPB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.