CD100 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405956-ACT

SEMA4D (CD100) è una semaforina transmembrana ampiamente espressa nelle linee cellulari immunitarie e neuronali, che segnala principalmente attraverso i recettori della famiglia plexin-B e CD72 per coordinare la comunicazione cellula-cellula. CD100 influenza il rimodellamento del citoscheletro, la migrazione e l’adesione tramite vie di segnalazione associate alle GTPasi della famiglia Rho e alle MAPK, modulando l’attivazione dei linfociti, la funzione delle cellule dendritiche e le interazioni neuroimmuni. Nel microambiente tumorale e nei tessuti infiammati, i segnali mediati da SEMA4D possono modulare l’infiltrazione immunitaria, le risposte angiogeniche e il rimodellamento stromale, rendendola un utile nodo molecolare per l’analisi delle vie di segnalazione in biologia del cancro, neuroinfiammazione e modelli rilevanti per le patologie autoimmuni. La sua espressione regolata fornisce inoltre un indicatore per studi sul controllo trascrizionale e sulla dinamica della segnalazione recettore–ligando nelle cellule umane.

CD100 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SEMA4D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD100 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SEMA4D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SEMA4D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD100. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SEMA4D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD100 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD100 nelle cellule tumorali con espressione di SEMA4D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.