cathepsin D Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400207-ACT

CTSD codifica la catepsina D, un’endopeptidasi aspartica lisosomiale essenziale per il turnover proteico intracellulare e per l’elaborazione degli antigeni attraverso il sistema endo-lisosomiale. Modulando la proteolisi mediata dai lisosomi e il flusso autofagia–lisosoma, la catepsina D influenza l’omeostasi cellulare, le risposte allo stress e il rimodellamento di substrati proteici extracellulari e intracellulari. Una disregolazione dell’espressione o dell’attività di CTSD è stata associata a neurodegenerazione, infiammazione e biologia tumorale, ambiti in cui un’alterata funzione lisosomiale può incidere su apoptosi, adattamento metabolico e fenotipi invasivi. Di conseguenza, CTSD è ampiamente studiato nelle vie che regolano la biogenesi lisosomiale, la proteostasi e il traffico endocitico.

cathepsin D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CTSD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cathepsin D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CTSD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CTSD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cathepsin D. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CTSD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cathepsin D nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cathepsin D nelle cellule tumorali con espressione di CTSD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.