CAD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403028-ACT

O fator de fragmentação do DNA, subunidade beta (DFFB), também conhecido como DNase ativada por caspase (CAD), é uma endonuclease que realiza a clivagem internucleossômica do DNA durante a apoptose após ser liberada de seu inibidor, ICAD. A CAD ativada contribui para a fragmentação da cromatina, a formação de corpos apoptóticos e a sinalização de dano ao DNA, conectando a morte celular programada às vias de integridade do genoma. Assim, a atividade de DFFB é relevante para estudos de regulação da apoptose, homeostase imune e respostas celulares ao estresse genotóxico. Alterações no controle da fragmentação apoptótica do DNA têm sido associadas à sobrevivência oncogênica, fenótipos inflamatórios e processos neurodegenerativos, tornando o DFFB um alvo útil para investigações mecanísticas.

CAD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DFFB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CAD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DFFB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DFFB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CAD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DFFB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CAD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CAD em células tumorais com expressão de DFFB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.