C/EBP ε Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402310-ACT

CEBPE codifica C/EBP ε, un fattore di trascrizione bZIP ristretto alla linea mieloide che coordina le fasi tardive della granulopoiesi e la maturazione funzionale dei neutrofili. Legandosi agli elementi CCAAT/enhancer e cooperando con regolatori di linea come GFI1 e SPI1/PU.1, C/EBP ε modula programmi trascrizionali che controllano l’uscita dal ciclo cellulare, l’espressione delle proteine dei granuli e le vie effettrici dell’immunità innata. L’alterazione dell’espressione o dell’attività di CEBPE compromette la differenziazione dei neutrofili ed è associata a difetti della funzione dei granulociti, rendendolo un nodo utile per studiare lo sviluppo ematopoietico e la segnalazione infiammatoria. Nei modelli di biologia tumorale e immunitaria, una trascrizione regolata da CEBPE alterata può fungere da indicatore di un impegno di linea mieloide e di uno stato di maturazione disfunzionali.

C/EBP ε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CEBPE senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C/EBP ε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CEBPE nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CEBPE, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C/EBP ε. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CEBPE nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C/EBP ε nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C/EBP ε nelle cellule tumorali con espressione di CEBPE silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.