BRUNOL4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404263-ACT

Il gene umano **CELF4** (BRUNOL4) codifica una proteina legante l’RNA della famiglia CELF/BRUNO-like, che regola lo splicing alternativo, la stabilità dell’mRNA e la traduzione attraverso il riconoscimento di elementi ricchi in U/G nei pre-mRNA e nelle regioni 3′ UTR. BRUNOL4 contribuisce a programmi di controllo genico post-trascrizionale che modellano la differenziazione neuronale e l’espressione genica dipendente dall’attività, influenzando la funzione sinaptica e le reti di processamento dell’RNA. Un’alterata regolazione dello splicing e dell’omeostasi dell’mRNA dipendenti da CELF4 è stata associata a fenotipi del neurosviluppo e a meccanismi di malattie neurologiche, inclusi cambiamenti dell’eccitabilità e una maggiore suscettibilità alle crisi. Queste caratteristiche rendono CELF4 un bersaglio utile per analizzare le vie di regolazione dell’RNA e il controllo delle isoforme trascrittomiche in modelli cellulari umani.

BRUNOL4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CELF4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BRUNOL4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CELF4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CELF4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BRUNOL4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CELF4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BRUNOL4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BRUNOL4 nelle cellule tumorali con espressione di CELF4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.