BRAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403847-ACT

BRAP (proteina associata a BRCA1) è una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo RING citoplasmatica che modula la stabilità proteica e l’output della segnalazione coordinando il controllo, dipendente dall’ubiquitinazione, dei componenti delle vie di segnalazione. È stata implicata nella regolazione della dinamica della segnalazione MAPK/ERK, influenzando la progressione del ciclo cellulare, le risposte allo stress e la proteostasi attraverso effetti sul turnover mediato dall’ubiquitina e sull’attenuazione del segnale. Modellando la trasduzione del segnale e le vie infiammatorie/di stress, l’espressione di BRAP e le sue varianti funzionali sono state associate ad alterazioni dell’omeostasi cellulare e a una maggiore suscettibilità a fenotipi rilevanti per la malattia, inclusi processi cardiometabolici e legati alla neurodegenerazione. Queste proprietà rendono BRAP un bersaglio utile per analizzare come le reti di ligasi dell’ubiquitina regolino finemente la segnalazione guidata dalla fosforilazione e i programmi trascrizionali a valle nelle cellule umane.

BRAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BRAP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BRAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BRAP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BRAP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BRAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BRAP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BRAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BRAP nelle cellule tumorali con espressione di BRAP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.