BIGM103 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403471-ACT

SLC39A8 codifica o transportador humano de iões metálicos ZIP8, que regula a captação celular de catiões divalentes como Mn2+ e Zn2+ e, assim, sustenta a atividade de metaloenzimas, a função mitocondrial e a homeostase redox. Ao modular a disponibilidade intracelular de manganês, SLC39A8 influencia a capacidade de glicosilação e redes de sinalização metabólica mais amplas que dependem de enzimas que requerem Mn2+. Alterações na expressão ou na função de SLC39A8 têm sido associadas a desregulação da homeostase de metais e a efeitos subsequentes na sinalização inflamatória e nas respostas celulares ao stress. Estas ligações tornam o SLC39A8 (BIGM103) relevante para estudos mecanísticos de transporte de metais, biologia dos glicanos e perturbações de vias em modelos de células humanas.

BIGM103 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC39A8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BIGM103 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC39A8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC39A8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BIGM103. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC39A8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BIGM103 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BIGM103 em células tumorais com expressão de SLC39A8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.