BI-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404349-ACT

TMBIM6 codifica BI-1, una proteina di membrana del reticolo endoplasmatico che sopprime l’apoptosi modulando l’omeostasi del calcio nel RE e attenuando la segnalazione dello stress del RE. BI-1 influenza le vie della risposta alle proteine mal ripiegate (UPR), incluse le cascata PERK–eIF2α e la segnalazione mediata da IRE1, e può modulare lo stress ossidativo e il crosstalk mitocondriale che determinano la sopravvivenza cellulare in condizioni di stress proteotossico. Grazie a queste funzioni, TMBIM6 è frequentemente studiato nel contesto dell’adattamento cellulare allo stress cronico, con associazioni riportate alla sopravvivenza delle cellule tumorali, alla vulnerabilità allo stress legata alla neurodegenerazione e a risposte infiammatorie guidate da un’alterata proteostasi.

BI-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMBIM6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BI-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMBIM6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMBIM6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BI-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMBIM6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BI-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BI-1 nelle cellule tumorali con espressione di TMBIM6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.