BBS8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404755-ACT

TTC8 codifica BBS8, un componente fondamentale del complesso BBSome che coordina il traffico di cargo da e verso il ciglio primario, supportando lo smistamento delle proteine di membrana ciliare e i processi legati al trasporto intraflagellare. Attraverso la regolazione della segnalazione dipendente dalle ciglia, inclusi Sonic hedgehog e il traffico dei GPCR, BBS8 contribuisce a mantenere la polarità cellulare e la segnalazione sensoriale in molteplici tessuti. L’alterazione genetica o la disfunzione di BBS8 è associata alla sindrome di Bardet–Biedl e a ciliopatie correlate, che presentano fenotipi pleiotropici coerenti con un’alterazione della struttura e della segnalazione ciliare. Nei modelli cellulari umani, perturbare l’espressione di TTC8 offre un approccio gestibile per studiare la proteostasi ciliare, il trasporto vescicolare e il rimodellamento delle vie a valle di una segnalazione ciliare alterata.

BBS8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TTC8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BBS8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TTC8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TTC8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BBS8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TTC8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BBS8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BBS8 nelle cellule tumorali con espressione di TTC8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.