Barx1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419290-ACT

Il gene Barx1 del topo codifica un fattore di trascrizione homeobox che regola le interazioni epitelio–mesenchima durante lo sviluppo embrionale, con ruoli di rilievo nella definizione dei pattern cranio-facciali, nei derivati degli archi branchiali e nell’organogenesi del tratto gastrointestinale. BARX1 influenza la specificazione di linea e la compartimentalizzazione dei tessuti modulando programmi trascrizionali legati alla segnalazione dei morfogeni, inclusa l’interazione (crosstalk) tra le vie BMP e Wnt che contribuisce a determinare l’identità regionale. Nello stomaco, Barx1 è implicato nel controllo di segnali mesenchimali che limitano la differenziazione dell’epitelio e sostengono un corretto sviluppo delle ghiandole. Reti trascrizionali associate a BARX1 alterate sono state collegate ad anomalie dello sviluppo e vengono frequentemente studiate in modelli di dismorfogenesi, patterning d’organo e cambiamenti del destino cellulare rilevanti per la malattia.

Barx1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Barx1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Barx1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Barx1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Barx1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Barx1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Barx1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Barx1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Barx1 nelle cellule tumorali con espressione di Barx1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.