ARV1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407460-ACT

ARV1 (omologo di ARV1) codifica una proteina di membrana multipasso, evolutivamente conservata, localizzata prevalentemente nel reticolo endoplasmatico e implicata nell’omeostasi lipidica. Nell’uomo, ARV1 è stato associato al traffico di steroli e sfingolipidi, al mantenimento della composizione di membrana e al coordinamento di processi dipendenti dal RE che influenzano la funzione della via secretoria e le risposte cellulari allo stress. Attraverso il suo ruolo nell’organizzazione dell’equilibrio lipidico e nella dinamica delle membrane, ARV1 può incidere su reti di segnalazione collegate all’integrità degli organelli e alla proteostasi. Alterazioni dell’espressione di ARV1 sono state associate, in studi genetici, a fenotipi neuroevolutivi ed epilettici, a supporto della sua rilevanza per ricerche sui meccanismi di malattia in contesti metabolici e neurologici.

ARV1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARV1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARV1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARV1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARV1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARV1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARV1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARV1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARV1 nelle cellule tumorali con espressione di ARV1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.