AP-2μ1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403095-ACT

AP2M1 codifica la subunità μ1 del complesso adattatore AP-2, un componente fondamentale dell’endocitosi mediata da clatrina a livello della membrana plasmatica. AP-2μ1 riconosce i motivi di smistamento del carico e coordina l’assemblaggio del rivestimento per regolare l’internalizzazione e il riciclo di recettori, trasportatori e complessi di segnalazione, influenzando l’omeostasi di membrana e l’attenuazione del segnale. Attraverso il suo ruolo nel traffico vescicolare, AP2M1 incide su vie quali la segnalazione dei recettori tirosin-chinasici, la desensibilizzazione dei GPCR e il ciclo delle vescicole sinaptiche. La disregolazione dell’endocitosi dipendente da AP-2 è associata ad alterazioni della segnalazione e del traffico intracellulare rilevanti per la neurobiologia, la dinamica dei recettori nelle cellule tumorali e altri meccanismi patologici legati allo stress endocitico.

AP-2μ1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AP2M1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AP-2μ1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AP2M1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AP2M1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AP-2μ1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AP2M1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AP-2μ1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AP-2μ1 nelle cellule tumorali con espressione di AP2M1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.