AOX1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403997-ACT

L’AOX1 umano codifica l’aldeide ossidasi 1, un enzima citosolico dipendente dal molibdeno che catalizza l’ossidazione di diverse aldeidi e di composti N‑eterociclici durante la fase I del metabolismo degli xenobiotici. AOX1 partecipa all’omeostasi redox e si integra in reti metaboliche più ampie generando specie reattive dell’ossigeno come sottoprodotti e contribuendo alla rimozione di aldeidi endogene prodotte durante la perossidazione lipidica. Variazioni nell’espressione o nell’attività di AOX1 possono modificare la sensibilità cellulare allo stress ossidativo e influenzare fenotipi metabolici, rendendola rilevante per studi sulla funzione epatica e sulla capacità di detossificazione. Una gestione disfunzionale delle aldeidi è stata collegata a processi infiammatori e fibrotici, supportando l’indagine di AOX1 come modificatore in modelli di danno metabolico e ossidativo.

AOX1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AOX1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AOX1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AOX1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AOX1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AOX1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AOX1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AOX1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AOX1 nelle cellule tumorali con espressione di AOX1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.