Plásmido CRISPR de Activación (h) ANO4: sc-406887-ACT

El ANO4 humano (anoctamina 4) codifica un miembro de la familia TMEM16/anoctaminas de proteínas de membrana multipaso, implicadas en el transporte de aniones y fosfolípidos en las membranas celulares. La actividad de ANO4 se ha vinculado con el remodelado de membrana regulado por Ca2+, incluidos procesos como el “scrambling” (redistribución) de fosfolípidos, que puede influir en el tráfico vesicular, la señalización celular y las respuestas al estrés. A través de estas funciones, ANO4 se integra en vías que acoplan la dinámica del calcio intracelular con cambios en la composición y la excitabilidad de la membrana. La alteración de la función de la familia TMEM16, incluido ANO4, es de interés en estudios sobre fenotipos neurológicos, biología de plaquetas y células inmunitarias, y adaptaciones de señalización de membrana asociadas al cáncer.

ANO4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ANO4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ANO4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ANO4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ANO4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ANO4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ANO4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ANO4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ANO4 en células tumorales con expresión de ANO4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.