3PGDH Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401405-ACT

PHGDH umano codifica la 3-fosfoglicerato deidrogenasi (3PGDH), il primo enzima e quello limitante la velocità della via di biosintesi de novo della serina, che devia l’intermedio glicolitico 3-fosfoglicerato verso la L-serina e, a valle, verso il metabolismo a un carbonio. Attraverso il controllo dei pool di serina e glicina, PHGDH influenza la sintesi dei nucleotidi, le reazioni di metilazione e l’equilibrio redox cellulare tramite un metabolismo accoppiato a NADH/NADPH. La disregolazione di PHGDH è stata associata alla riprogrammazione metabolica in stati proliferativi e a fenotipi neurometabolici in cui la disponibilità di serina limita i processi biosintetici legati a proteine, lipidi e neurotrasmettitori. In quanto nodo di via che collega la glicolisi al flusso di amminoacidi e del ciclo dei folati, la 3PGDH è spesso oggetto di studio in ricerche sulla dipendenza dai nutrienti, sul crosstalk metabolico mitocondrio–citosol e sull’adattamento allo stress.

3PGDH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PHGDH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

3PGDH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PHGDH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PHGDH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di 3PGDH. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PHGDH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da 3PGDH nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via 3PGDH nelle cellule tumorali con espressione di PHGDH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.