ZO-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400196-ACT

O TJP1 humano codifica a zonula occludens-1 (ZO-1), uma proteína de andaime multidomínio que organiza os complexos de junções apertadas ao conectar claudinas e ocludina ao citoesqueleto cortical de actina por meio de interações mediadas por domínios PDZ. A ZO-1 coordena a formação de barreiras epiteliais e endoteliais, a polaridade ápico-basal e a mecanotransdução nas junções, integrando sinais que influenciam a remodelação do citoesqueleto e o controle do crescimento dependente de contato. Por meio dessas funções, TJP1/ZO-1 contribui para a regulação da permeabilidade paracelular e de programas de migração celular relevantes a processos como transições epitélio–mesênquima e remodelamento tecidual. A localização ou expressão desregulada de ZO-1 é frequentemente investigada na patobiologia associada a barreiras, incluindo alterações de permeabilidade ligadas à inflamação e fenótipos de progressão tumoral em diversos contextos epiteliais.

ZO-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TJP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ZO-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TJP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TJP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ZO-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TJP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ZO-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ZO-1 em células tumorais com expressão de TJP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.