XylT-II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404853-ACT

Il gene umano **XYLT2** codifica la xilosiltransferasi II (XylT-II), una glicosiltransferasi residente nel Golgi che catalizza il trasferimento iniziale di xilosio su specifici residui di serina delle proteine core dei proteoglicani, avviando l’assemblaggio delle catene di glicosaminoglicani (GAG). Questo passaggio precoce sostiene l’organizzazione della matrice extracellulare e influenza vie legate all’adesione cellulare, alla meccanotrasduzione e alla segnalazione dei fattori di crescita attraverso proteoglicani a eparan solfato e a condroitin/dermatan solfato. L’attività di **XYLT2** contribuisce quindi alla biosintesi dei proteoglicani e a reti più ampie di glicosilazione che modellano l’architettura tissutale e la comunicazione intercellulare. Alterazioni genetiche delle vie di assemblaggio dei proteoglicani che coinvolgono **XYLT2** sono state associate a fenotipi del tessuto connettivo e dello scheletro, rendendolo rilevante per lo studio della biologia della matrice e dei meccanismi di malattia correlati alla glicosilazione.

XylT-II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di XYLT2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

XylT-II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus XYLT2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione XYLT2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di XylT-II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus XYLT2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da XylT-II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via XylT-II nelle cellule tumorali con espressione di XYLT2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.