VPS26B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410249-ACT

VPS26B codifica um componente central do complexo retromer, que governa a triagem e a reciclagem de cargas endossomais dos endossomos para a rede trans-Golgi e para a membrana plasmática. Por meio da coordenação com VPS35 e VPS29, o VPS26B ajuda a manter a homeostase de proteínas de membrana, regula o tráfego de receptores e dá suporte à função lisossomal ao limitar a maturação endossomal aberrante. Vias dependentes do retromer influenciam a sinalização celular, a localização de transportadores de nutrientes e a proteostase intracelular, vinculando a atividade do VPS26B a processos mais amplos, como a autofagia e as respostas ao estresse endolisossomal. A desregulação do tráfego endossomal e da função do retromer tem sido implicada em fenótipos neurodegenerativos e do desenvolvimento, tornando o VPS26B um alvo relevante para estudos mecanísticos da biologia de doenças associadas ao tráfego de membranas.

VPS26B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VPS26B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPS26B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VPS26B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VPS26B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPS26B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VPS26B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPS26B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPS26B em células tumorais com expressão de VPS26B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.