Usherin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409699-ACT

USH2A codifica a usherina, uma grande proteína transmembrana associada à matriz extracelular, enriquecida em epitélios sensoriais, onde sustenta a arquitetura e a mecanotransdução de fotorreceptores e de células ciliadas do ouvido interno. A usherina participa da organização de redes de proteínas de Usher e contribui para interações célula–célula e célula–matriz que estabilizam os feixes de estereocílios e o complexo da membrana periciliar. Por meio dessas funções, o USH2A está ligado a processos que regulam a ciliogênese, a adesão e o tráfego em células polarizadas. Alterações genéticas em USH2A estão fortemente associadas à degeneração retiniana hereditária e a fenótipos sindrômicos de audição/visão, tornando-o um locus-chave para o estudo da manutenção de células sensoriais e dos mecanismos de degeneração.

Usherin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de USH2A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Usherin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus USH2A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição USH2A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Usherin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus USH2A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Usherin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Usherin em células tumorais com expressão de USH2A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.