UPII Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402242-ACT

O UPK2 codifica a uroplaquina II (UPII), um componente integral das placas apicais do urotélio que ajudam a formar a membrana de unidade assimétrica e sustentam as propriedades de barreira das células “umbrella” diferenciadas. A UPII se monta com outras uroplaquinas na via secretória e é transportada até a superfície apical, contribuindo para a organização da membrana, a polaridade epitelial e a estabilidade mecânica no trato urinário. Como um marcador restrito à linhagem da diferenciação urotelial, a expressão alterada de UPK2 é amplamente utilizada para estudar mudanças em programas de maturação epitelial e na identidade celular na biologia da bexiga. Padrões desregulados de expressão de uroplaquinas são frequentemente investigados no contexto de patologias uroteliais, incluindo estados de diferenciação associados a tumores e função de barreira alterada.

UPII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UPK2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UPII O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UPK2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UPK2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UPII. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UPK2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UPII no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UPII em células tumorais com expressão de UPK2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.