UPIa Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402951-ACT

O UPK1A humano codifica a uroplaquina-1a (UPIa), uma proteína de membrana tetraspan que se associa a outras uroplaquinas para formar placas uroteliais rígidas na superfície apical das células “guarda-chuva”. Essas placas sustentam a integridade da barreira epitelial e contribuem para o tráfego de membrana e para programas de diferenciação terminal que mantêm a arquitetura especializada do trato urinário. A expressão de UPK1A é comumente usada como marcador de linhagem de urotélio diferenciado, e sua desregulação é estudada no contexto do remodelamento urotelial e da biologia do câncer de bexiga. Alterações na composição das uroplaquinas podem afetar as interações célula–célula e a organização da membrana apical, processos relevantes para o fenótipo tumoral e a plasticidade epitelial.

UPIa O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UPK1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UPIa O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UPK1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UPK1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UPIa. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UPK1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UPIa no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UPIa em células tumorais com expressão de UPK1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.