TRIM32 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402731-ACT

TRIM32 codifica uma ligase E3 de ubiquitina da família TRIM que regula a homeostase proteica ao catalisar a ubiquitinação de substratos e coordenar a degradação pelo proteassoma. Por meio dos seus domínios RING, B-box, coiled-coil e repetições NHL, a TRIM32 influencia a diferenciação miogênica, a organização do citoesqueleto e a sinalização responsiva ao estresse, com associações descritas a vias que incluem NF-κB e o controle de qualidade relacionado à autofagia. Na biologia humana, alterações na função de TRIM32 estão associadas a fenótipos neuromusculares, como distrofia muscular de cinturas e miopatia congênita, e a expressão desregulada tem sido estudada em contextos relevantes para tumores, nos quais a proteostase e programas transcricionais são remodelados. Essas características fazem da TRIM32 um nó útil para dissecar a regulação dependente de ubiquitina, transições de estado de células musculares e relações genótipo–fenótipo em modelos celulares.

TRIM32 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TRIM32 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TRIM32 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TRIM32 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TRIM32, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TRIM32. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TRIM32 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TRIM32 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TRIM32 em células tumorais com expressão de TRIM32 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.