tricellulin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-414734-ACT

MARVELD2 codifica a tricelulina, uma proteína de membrana tetraspânica enriquecida nas junções estreitas tricelulares, onde três células epiteliais se encontram. A tricelulina contribui para a integridade das barreiras epiteliais e endoteliais ao organizar complexos juncionais e regular o fluxo paracelular, atuando em conjunto com claudinas, ocludina e proteínas de ancoragem como a ZO-1. Por meio do seu papel na montagem das junções estreitas e na polaridade, MARVELD2 influencia processos como diferenciação epitelial, mecanotransdução e homeostase tecidual. A desregulação ou variação genética em MARVELD2 tem sido associada a fisiopatologia relacionada à barreira, incluindo formas sindrômicas e não sindrômicas de perda auditiva, tornando-o relevante para estudos de epitélios sensoriais e mecanismos de doença das junções.

tricellulin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MARVELD2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

tricellulin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MARVELD2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MARVELD2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de tricellulin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MARVELD2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de tricellulin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via tricellulin em células tumorais com expressão de MARVELD2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.