TRC8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403689-ACT

O RNF139 humano codifica a TRC8, uma proteína de membrana do retículo endoplasmático com múltiplas passagens que atua como uma ligase E3 de ubiquitina do tipo RING e modula o controle de qualidade e a degradação de proteínas. A TRC8 integra processos de detecção de esteróis e de degradação dependente de ubiquitina, influenciando a degradação associada ao RE (ERAD) e vias mais amplas de proteostase. Ao regular a ubiquitinação de substratos, o RNF139 pode impactar programas celulares ligados ao controle de crescimento, respostas ao estresse e homeostase de proteínas de membrana. Alterações na atividade de RNF139/TRC8 têm sido estudadas no contexto de rearranjos genômicos e de sinalização de ubiquitina desregulada observados na biologia do câncer e em transições relacionadas de estados celulares.

TRC8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RNF139 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TRC8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RNF139 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RNF139, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TRC8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RNF139 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TRC8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TRC8 em células tumorais com expressão de RNF139 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.