TRAP230 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404820-ACT

MED12 codifica TRAP230, una subunità centrale del complesso coattivatore trascrizionale Mediator, che collega i fattori di trascrizione specifici di sequenza all’RNA polimerasi II per coordinare i programmi di espressione genica. TRAP230 è coinvolta nella trascrizione dipendente dal segnale, incluse le vie a valle di Wnt/β-catenina, dei recettori nucleari e di altri regolatori dello sviluppo, influenzando così le decisioni sul destino cellulare, la proliferazione e la differenziazione. Alterazioni della funzione o dell’espressione di MED12 sono state associate a sindromi del neurosviluppo e a molteplici contesti tumorali attraverso un controllo trascrizionale e un’attività degli enhancer deregolati. Di conseguenza, MED12/TRAP230 è ampiamente studiato nell’ambito dell’espressione genica regolata dalla cromatina, della specificazione di linea cellulare e del rimodellamento delle reti trascrizionali.

TRAP230 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MED12 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRAP230 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MED12 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MED12, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRAP230. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MED12 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRAP230 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRAP230 nelle cellule tumorali con espressione di MED12 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.