TPR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402928-ACT

Humanes TPR kodiert ein großes, coiled-coil-haltiges Nukleoporin, das ein zentrales Gerüst des Kernporenkörbchens bildet und den nukleozytoplasmatischen Transport sowie die übergeordnete Organisation des Zellkerns unterstützt. TPR trägt zum mRNA-Export und zur Qualitätskontrolle bei, interagiert während der Mitose mit dem Spindel-Checkpoint und hilft durch die Koordination kernhüllenassoziierter Prozesse, die Genomstabilität zu erhalten. Infolge dieser Funktionen werden veränderte TPR-Regulation oder Fusionsereignisse mit fehlregulierter Signalübertragung und chromosomalen Umlagerungen in verschiedenen Krebszusammenhängen in Verbindung gebracht, was TPR für Studien zu onkogenen Transkriptionsprogrammen und zur Zellzykluskontrolle relevant macht. Zudem wird die TPR-Funktion häufig in Signalwegen untersucht, die RNA-Prozessierung, mitotische Genauigkeit und stressresponsive nukleäre Transportvorgänge steuern.

TPR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TPR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TPR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TPR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TPR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TPR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TPR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TPR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TPR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TPR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.