TPR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402928-ACT

O TPR humano codifica uma nucleoporina grande, rica em hélices em coiled-coil, que forma um componente estrutural essencial da cesta do poro nuclear, dando suporte ao transporte núcleo–citoplasma e à organização nuclear de ordem superior. O TPR contribui para a exportação e a vigilância de mRNA, interage com o checkpoint do fuso durante a mitose e ajuda a manter a estabilidade do genoma por meio da coordenação de processos associados ao envelope nuclear. Em função desses papéis, alterações na regulação do TPR ou eventos de fusão foram associados a sinalização desregulada e a rearranjos cromossômicos observados em múltiplos contextos de câncer, tornando-o relevante para estudos de programas transcricionais oncogênicos e do controle do ciclo celular. A função do TPR também é comumente investigada em vias que regulam o processamento de RNA, a fidelidade mitótica e o tráfego nuclear responsivo ao estresse.

TPR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TPR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TPR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TPR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TPR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TPR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TPR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TPR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TPR em células tumorais com expressão de TPR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.