TORC2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402481-ACT

O CRTC2 (TORC2) humano é um coativador de transcrição regulado por CREB que integra a sinalização de cAMP/PKA e de cálcio com programas de expressão génica metabólica. Ao acoplar o CREB à atividade de promotores/enhancers, o TORC2 ajuda a controlar as respostas transcricionais da gluconeogénese e do metabolismo lipídico e contribui para respostas adaptativas como o equilíbrio energético e a sinalização de stress. A sua atividade é modulada pela retenção citoplasmática dependente de fosforilação e pela translocação para o núcleo, ligando vias de cinases a montante ao controlo transcricional. A desregulação da sinalização de CRTC2 tem sido associada a alterações na homeostase metabólica e a perturbações em redes transcricionais relevantes para fenótipos metabólicos e proliferativos.

TORC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CRTC2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TORC2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CRTC2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CRTC2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TORC2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CRTC2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TORC2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TORC2 em células tumorais com expressão de CRTC2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.