TMEM45A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-412437-ACT

TMEM45A codifica uma proteína transmembrana de múltiplas passagens implicada na diferenciação epitelial e na adaptação celular ao estresse do microambiente, com enriquecimento relatado em tecidos hipóxicos e queratinizantes. TMEM45A tem sido associada à regulação do tráfego de membranas e de programas de resposta ao estresse que influenciam proliferação, sobrevivência e processos relacionados à função de barreira. Alterações transcricionais em TMEM45A foram observadas em vários tipos tumorais, sustentando seu uso como gene associado a marcadores em estudos de remodelamento induzido por hipóxia e de vias de resposta ao tratamento. Como um fator localizado na membrana com expressão dependente do contexto, TMEM45A é frequentemente investigada por sua contribuição para a plasticidade de células tumorais e para a heterogeneidade fenotípica.

TMEM45A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TMEM45A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TMEM45A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TMEM45A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TMEM45A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TMEM45A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TMEM45A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TMEM45A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TMEM45A em células tumorais com expressão de TMEM45A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.