TM CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400956-ACT

THBD kodiert Thrombomodulin (TM), ein Oberflächenglykoprotein endothelialer Zellen, das Thrombin bindet und dessen Substratspezifität so verschiebt, dass die Aktivierung von Protein C gefördert wird – und damit die Kontrolle der Gerinnung mit antiinflammatorischer Signalgebung verknüpft. TM trägt zur vaskulären Homöostase bei, indem es thrombinvermittelte, proteaseaktivierte Rezeptor-(PAR)-Signalwege moduliert, die Fibrinbildung begrenzt und die endotheliale Barrierefunktion sowie Leukozytenadhäsion reguliert. Eine veränderte THBD-Expression oder -Funktion ist mit einer gestörten Hämostase und inflammatorischen vaskulären Phänotypen assoziiert und wird häufig in Zusammenhängen wie Thromboseanfälligkeit, sepsisassoziierter Koagulopathie und endothelialer Dysfunktion untersucht. Als transkriptionell responsiver Endothelmarker dient THBD zudem als Ausleseparameter für Scherstress, Zytokinexposition und Programme der vaskulären Differenzierung.

TM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen THBD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des THBD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der THBD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TM-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native THBD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TM-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TM-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem THBD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.