Titin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402827-ACT

Il gene umano **TTN** codifica la titina, una gigantesca proteina sarcomerica che si estende dal disco Z alla linea M e funge da impalcatura molecolare e da molla per mantenere l’integrità delle miofibrille, l’elasticità passiva e la trasmissione della forza nel muscolo striato. La titina coordina l’assemblaggio del sarcomero tramite interazioni con l’actina, la miosina e i complessi del disco Z/della linea M, e contribuisce ai processi di meccanosensing che collegano lo stiramento al rimodellamento dell’apparato contrattile. L’attività di **TTN** è integrata con le vie di omeostasi strutturale del muscolo, inclusi l’organizzazione del citoscheletro, il controllo qualità delle proteine e la segnalazione responsiva allo stress che modella la funzione dei cardiomiociti e delle miofibre scheletriche. La variabilità genetica e la disregolazione di **TTN** sono fortemente associate a fenotipi di malattie muscolari, rendendolo un locus centrale per lo studio della biologia del sarcomero e delle relazioni genotipo–funzione in modelli umani.

Titin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TTN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Titin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TTN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TTN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Titin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TTN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Titin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Titin nelle cellule tumorali con espressione di TTN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.