Thymidine Kinase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402954-ACT

O TK1 humano codifica a timidina quinase 1, uma enzima citosólica que fosforila a timidina em monofosfato de timidina na via de salvamento de pirimidinas, mantendo níveis equilibrados de dTTP necessários para a replicação e o reparo do DNA. A expressão de TK1 está intimamente ligada à fase S e ao estado proliferativo, integrando-se com a regulação do ciclo celular e com programas de metabolismo de nucleotídeos que influenciam a estabilidade do genoma. Alterações na atividade e na expressão de TK1 têm sido associadas à proliferação desregulada e a respostas a dano no DNA na biologia do câncer e em outros contextos em que o estresse replicativo é proeminente. Como indicador e determinante da homeostase de nucleotídeos, o TK1 é frequentemente utilizado para estudar a dinâmica de replicação, o fluxo da via de salvamento e o controle metabólico dependente do ciclo celular.

Thymidine Kinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Thymidine Kinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Thymidine Kinase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Thymidine Kinase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Thymidine Kinase em células tumorais com expressão de TK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.