Plásmido CRISPR de Activación (m) TDAG8: sc-420643-ACT

El gen murino **Gpr65** codifica **TDAG8**, un receptor acoplado a proteína G sensible a protones que detecta la acidosis extracelular y transduce señales mediante la producción de **AMPc** dependiente de **Gαs** y programas transcripcionales posteriores. La actividad de TDAG8 influye en la activación de las células inmunitarias, las respuestas de citocinas y las decisiones de supervivencia en microambientes ácidos, vinculando la detección de pH con la señalización inflamatoria y la función de los leucocitos. Además de las vías de segundos mensajeros propias de los GPCR, TDAG8 puede interactuar con redes de respuesta al estrés que modulan la quimiotaxis y la remodelación tisular. La señalización desregulada de Gpr65/TDAG8 se ha asociado con mecanismos de enfermedades mediadas por el sistema inmunitario e interacciones tumor–inmunidad en las que la acidosis es una señal contextual clave, lo que respalda su uso en estudios mecanísticos de la inflamación y de la detección del microambiente.

TDAG8 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Gpr65 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TDAG8 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Gpr65 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Gpr65, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TDAG8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Gpr65 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TDAG8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TDAG8 en células tumorales con expresión de Gpr65 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.