TBC1D7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403595-ACT

TBC1D7 codifica una piccola proteina contenente un dominio TBC che funge da componente centrale del complesso TSC1–TSC2–TBC1D7, un importante regolatore negativo della segnalazione di mTORC1. Stabilizzando il complesso TSC e supportando l’attività GAP nei confronti di RHEB, TBC1D7 contribuisce a collegare i segnali provenienti da fattori di crescita e nutrienti al controllo della sintesi proteica, dell’autofagia e del metabolismo cellulare. Alterazioni del dosaggio o della funzione di TBC1D7 sono state associate a una deregolazione dell’attività della via mTOR e a fenotipi compatibili con una compromissione della rete oncosoppressiva. Di conseguenza, TBC1D7 è ampiamente studiato in contesti quali il controllo della crescita cellulare, le risposte allo stress e il crosstalk tra vie di segnalazione che influenzano proliferazione e differenziamento.

TBC1D7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TBC1D7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TBC1D7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TBC1D7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TBC1D7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TBC1D7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TBC1D7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TBC1D7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TBC1D7 nelle cellule tumorali con espressione di TBC1D7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.